Progetto Mitofusina

MODELLI MURINI TRANSGENICI

Un organismo modello è una specie ampiamente studiata per comprendere specifici fenomeni biologici, partendo dal presupposto che le informazioni acquisite sull’organismo modello possano fornire indicazioni sugli altri organismi. Questo è possibile perché gran parte delle caratteristiche biologiche, come i processi metabolici e di sviluppo oltre che i geni che li regolano, sono conservati nel corso dell’evoluzione.

La scelta dell’organismo modello dipende sicuramente dal tipo di ricerca che viene condotta. Quesiti di biologia molecolare sono più facilmente studiabili in organismi unicellulari o in virus, in quanto capaci di crescere rapidamente in grandi quantità, consentendo di combinare approcci genetici e biochimici. Lo studio però di altri quesiti come i processi di sviluppo o di patologie umane richiede sicuramente organismi più complessi. A questo proposito, il modello maggiormente utilizzato è quello murino, proprio per l’elevata similarità con l’uomo.

L’importanza oggi di sistemi modello è sicuramente incrementata dalla disponibilità di potenti strumenti di genetica molecolare che ne permettono la manipolazione genica. Topi modificati geneticamente per esprimere proteine normalmente assenti, per overesprimere proteine normali, per introdurre mutazioni geniche associate a patologie umane o per silenziare geni normalmente espressi hanno permesso di ottenere modelli murini importanti per lo studio degli effetti del silenziamento genico o della presenza di specifiche mutazioni simultaneamente in diversi tipi cellulari che potrebbero essere in linea di principio interessati in una precisa patologia.

Per lo studio di neuropatie da Mitofusina 2 (MFN2) come Charcot-Marie-Tooth disease di tipo 2A (CMT2A), è dunque utile la generazione di modelli transgenici murini caratterizzati dall’espressione del gene MNF2 codificante la proteina umana wild-type o con mutazioni associate a queste patologie. Questo potrebbe aiutare non solo a comprendere i meccanismi tramite cui queste mutazioni inducono neurodegenerazione, ma soprattutto ad identificare innovativi bersagli terapeutici.

In questa sezione cercheremo di riassumere le caratteristiche dei principali topi transgenici MFN2, i cui dati sono presenti in letteratura:

  • MitoCharc0
  • MitoCharc1
  • MFN2-T105M
  • Conditional Mfn2 loxP knockout
  • Modello murino: MitoCharc0

Transgene: Il transgene è costituito dalla forma wild-type del gene MFN2 umano la cui espressione è regolata da un’enolasi neurone-specifica.
Sviluppo: Il transgene è stato iniettato nel pronucleo maschile di oociti murini B6D2F1 fecondati. Gli embrioni ottenuti sono stati impiantati in femmine pseudo-gravide.
Sintomi: Il topo MitoCharc0 non mostra nessun sintomo clinico riconducibile alla patologia CMT2A
Referenze: Cartoni R, Arnaud E, Médard JJ, Poirot O, Courvoisier DS, Chrast R, Martinou JC. Expression of mitofusin 2(R94Q) in a transgenic mouse leads to Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 2A. Brain. 2010 May;133(Pt 5):1460-9. PubMed PMID: 20418531.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=20418531

Modello murino: MitoCharc1

Transgene: Il transgene MFN2-R94Q è costituito dalla forma mutata del gene umano MNF2 (sostituzione aminoacidica dell’arginina con la glutamina a livello del codone 94; R94Q) la cui espressione è regolata da un’enolasi neurone specifica
Sviluppo: Il transgene è stato microiniettato nel pronucleo maschile di oociti murini B6D2F1 fecondati. Gli embrioni ottenuti sono stati impiantati in femmine pseudo-gravide.
Sintomi: Il topo MitoCharc1 mostra i tipici sintomi della CMT2A, tra cui difficoltà motorie e una variazione della dimensione degli assoni mielinizzati correlata ad un incremento del numero dei mitocondri in questi assoni a 5 mesi di età. I dosaggi enzimatici rilevano un difetto combinato dei complessi mitocondriale II e V (riduzione del 40 e 30% rispettivamente).
Referenze: Cartoni R, Arnaud E, Médard JJ, Poirot O, Courvoisier DS, Chrast R, Martinou JC. Expression of mitofusin 2 (R94Q) in a transgenic mouse leads to Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 2A. Brain. 2010 May;133(Pt 5):1460-9. PubMed PMID: 20418531.
Guillet V, Gueguen N, Cartoni R, Chevrollier A, Desquiret V, Angebault C, Amati-Bonneau P, Procaccio V, Bonneau D, Martinou JC, Reynier P. Bioenergetic defect associated with mKATP channel opening in a mouse model carrying a mitofusin 2 mutation. FASEB J. 2011 May;25(5):1618-27. doi: 10.1096/fj.10-173609.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=20418531
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21285398

Modello murino: MFN2-T105M

Transgene: Il transgene MFN2-T105M è costituito dalla forma mutata del gene umano MNF2 (sostituzione aminoacidica della treonina con la metionina a livello del codone 105; MFN2-T105M) la cui espressione è regolata dal promotore HB9 specifico dei motoneuroni.
Sviluppo: Il transgene è stato microiniettato nel pronucleo maschile di oociti murini fecondati. Gli embrioni ottenuti sono stati impiantati in femmine pseudo-gravide.
Sintomi: Il topo MFN2-T105M mostra i tratti clinici della patologia CMT2A in modo dose dipendente. Presenta un grave difetto di andatura a causa di una incapacità a piegare le zampe posteriori. Questa debolezza muscolare distale è associata ad un ridotto numero di assoni nelle radici motorie e nei muscoli anteriori del polpaccio. Molti motoneuroni mostrano un’inappropriata distribuzione mitocondriale.
Referenze: Detmer SA, Vande Velde C, Cleveland DW, Chan DC. Hindlimb gait defects due to motor axon loss and reduced distal muscles in a transgenic mouse model of Charcot-Marie-Tooth type 2A. Hum Mol Genet. 2008 Feb 1;17(3):367-75. Epub 2007 Oct 24. PubMed PMID: 17959936.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=17959936

Modello murino: conditional Mfn2 loxP knockout

Transgene: il costrutto contiene due siti di ricombinazione loxP fiancheggianti l’esone 6 del gene MNF2 che codifica per il canonico motivo G1 GTPasi della proteina MNF2.
Sviluppo: Per generare il topo Mfn loxP, i cloni ES esprimenti i siti loxP sono stati iniettati in blastocisti C57BL/6. I topi risultanti sono stati mantenuti come omozigoti. I topi Mfn loxP sono stati incrociati con topi transgenici Wnt1-Cre o EN1-Cre per ottenere topi Mfn loxP condizionali, in cui il silenziamento del gene MNF2 si verifica solo a livello neuronale dove è espressa la Cre ricombinasi.
Sintomi: Il topo mostra uno sviluppo del cervelletto già a livello embrionale che continua dopo la nascita durante le prime tre settimane di vita. A P7 si osserva una riduzione del cervelletto. Le alterazioni del cervelletto sono coerenti con i difetti di movimento e con le anomalie di coordinazione motoria. Le Cellule di Purkinje sono caratterizzate da difetti ultrastrutturali e vanno incontro a degenerazione. Si osservano difetti di fusione mitocondriale associata a mancanza di nucleoidi a livello del dna mitocondriale (mtDNA).
Riferimenti: Chen H, McCaffery JM, Chan DC. Fusione mitocondriale protegge neurodegenerazione nel cervelletto. Cell. Ago 2007 10; 130 (3) :548-62.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=17693261