Progetto Mitofusina

IL NOSTRO PROGETTO DI RICERCA

Sviluppo di una strategia di terapia genica per la malattia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 2A (CMT2A)

Dott.ssa Federica Rizzo, Dott.ssa Monica Nizzardo, Prof.ssa Stefania Corti, Prof. Giacomo P. Comi

Centro Dino Ferrari, Università degli studi di Milano

La malattia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 2A (CMT2A) è una polineuropatia sensitivo-motoria, caratterizzata dalla morte dei neuroni motori e sensitivi. La patologia è dovuta a mutazioni nel gene MItofusina2 (MFN2) che codifica per la proteina MFN2 localizzata nella membrana esterna di un organello cellulare, essenziale per la sopravvivenza delle cellule e per il loro corretto funzionamento, il mitocondrio.

Obiettivo del nostro progetto di ricerca è di sviluppare un’efficace terapia, attualmente non disponibile, anche attraverso l’approfondimento delle conoscenze dei meccanismi responsabili della malattia.

A CHE PUNTO SIAMO CON LA RICERCA? 

In questo progetto, abbiamo inizialmente reclutato e sottoposto a biopsia cutanea pazienti CMT2A con diverse mutazioni nel gene MFN2 in modo da ottenere fibroblasti paziente specifici. La riprogrammazione di queste cellule mature in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) offre la possibilità di ottenere cellule paziente specifiche, come neuroni motori e sensitivi umani, tipicamente affetti nella patologia, ma impossibili da ottenere con altre strategie. In questo modo, abbiamo ottenuto diverse linee di iPSC da pazienti CMT2A e abbiamo dimostrato il differenziamento in motoneuroni paziente specifici. Le cellule così ottenute hanno mostrato alcuni aspetti tipici della patologia, come alterazioni della localizzazione dei mitocondri, riduzione della quantità del DNA mitocondriale e dell’attività dei complessi della catena respiratoria. Questo studio ha contribuito ad approfondire i meccanismi molecolari patogenetici attraverso la generazione del primo modello in vitro di malattia.

COSA CI PROPONIAMO DI FARE?

Accanto allo studio delle cause della patologia, il nostro progetto di ricerca ha lo scopo di sviluppare un possibile approccio terapeutico per la CMT2A, attualmente non disponibile. Ad oggi, la terapia genica rappresenta una promettente strategia in quanto finalizzata a correggere la causa genetica alla base della malattia stessa. Questo tipo di strategia sta dando risultati molto promettenti in trial clinici con vettori adeno-associato di tipo 9 (AAV9) per la forma comune di Atrofia Muscolare Spinale (SMA), un’altra malattia neuronmuscolare. Ci proponiamo di utilizzare lo stesso tipo di approccio per la CMT2A. Tuttavia, nel caso della CMT2A, non solo la mancanza del gene “sano”, ma anche la presenza della proteina MFN2 malata sono la causa stessa della patologia. Non è sufficiente quindi reintrodurre il gene “sano”, ma è necessario anche spegnere quello malato. In questa prospettiva, proponiamo un approccio combinato di silenziamento del gene MFN2 endogeno patologico mediante una strategia di RNA interference (RNAi) con short harpin RNA (shRNA) e di reintroduzione di una copia del gene MFN2 “sano” (MFN2R). 

Il progetto sarà sviluppato come segue:

Obiettivo 1. Valutazione dell’impatto della strategia terapeutica nel modello in vitro di malattia


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Valuteremo l’efficacia di questa strategia terapeutica nei motoneuroni paziente specifici, precedentemente differenziati dalle iPSC, osservando ogni modifica del fenotipo patologico dopo il trattamento.

Obiettivo2. Valutazione dell’impatto della strategia terapeutica nel modello in vivo di malattia

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Valuteremo l’efficacia di questa strategia terapeutica nel modello murino di CMT2A (MitoCharc1), l’unico attualmente disponibile in grado di riprodurre la patologia. In particolare, considereremo ogni modifica del fenotipo patologico dopo il trattamento.

Questa strategia potrà essere sviluppata successivamente per un’applicazione terapeutica in trial clinici in pazienti.

Aggiornato a settembre 2017


FUNCTIONAL ANALYSIS AND GENOME-WIDE RNA-SEQ OF HUMAN MOTOR NEURONS IMPLICATE SELECTIVE MITOCHONDRIAL DEPLETION, RESISTANCE TO APOPTOSIS AND INCREASED MITOPHAGY IN CHARCOT-MARIE-TOOTH 2A

Rizzo F, Ramirez A., Ronchi R., Salani S, Nizzardo M, Fortunato F, Bordoni A, Bresolin N, Comi GP, Corti S.
Dino Ferrari Centre, Neuroscience Section, Department of Pathophysiology and Transplantation(DEPT), Univerity of Milan, Neurology Unit, IRCCS Fondation Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Milan, Italy

La malattia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 2A (CMT2A) è una polineuropatia sensitivo-motoria, caratterizzata dalla morte dei neuroni motori e sensitivi, che risulta in una progressiva debolezza agli arti, atrofia muscolare e perdita della sensibilità. La patologia è dovuta a mutazioni nel gene Mitofusina2 (MFN2), che codifica per una proteina localizzata a livello dei mitocondri, organelli molto importanti per la sopravvivenza delle cellule e per il loro corretto funzionamento. Ad oggi, purtroppo non esistono terapie risolutive per questa patologia.
La riprogrammazione di queste cellule mature in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) offre la possibilità di ottenere cellule paziente specifiche, come motoneuroni e neuroni sensitivi umani, tipicamente affetti nella patologia, ma impossibili da ottenere direttamente dai pazienti con altre strategie. Nello studio pubblicato on-line il 9 agosto 2016, su Human Molecular Genetics, il team di ricerca del Centro Dino Ferrari, Università degli Studi di Milano, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico ha differenziato motoneuroni (MN) da iPSC derivate dalla biopsia cutanea di pazienti affetti da CMT2A. In questo modo, abbiamo generato un modello in vitro di malattia, attualmente non disponibile. Le cellule così ottenute hanno mostrato alcuni aspetti tipici della patologia, come la riduzione della quantità dei mitocondri e alterazioni della loro localizzazione, senza differenze significative in termini di sopravvivenza. Questi difetti sono risultati più evidenti nelle cellule neuronali rispetto ai fibroblasti cutanei, in accordo con la specificità neuronale della patologia. Nel complesso, questi dati suggeriscono che la riduzione dei mitocondri nei motoneuroni che esprimono la forma mutata di MFN2 non è il risultato di una ridotta produzione di mitocondri, ma più probabilmente la conseguenza della morte di questi organelli. Questi meccanismi rappresentano possibili nuovi bersagli terapeutici molecolari per lo sviluppo di una cura efficace per questa malattia.

Aggiornato a ottobre 2016

Sviluppo di una strategia terapeutica molecolare per la CMT2A attraverso l’uso di un modello in vitro con cellule staminali

Dr. Federica Rizzo, Dr. Stefania Corti, Prof. Giacomo P. Comi
Centro Dino Ferrari Università degli Studi di Milano

La malattia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 2A (CMT2A) è una polineuropatia sensitivo-motoria, caratterizzata dalla degenerazione dei neuroni motori e sensitivi, che risulta in una progressiva debolezza agli arti, atrofia muscolare e perdita della sensibilità. La patologia è dovuta a mutazioni nel gene Mitofusina 2 (MFN2), che codifica per una proteina localizzata a livello dei mitocondri, essenziale per la sopravvivenza delle cellule e per il loro corretto funzionamento. Ad oggi, purtroppo non esistono terapie risolutive per questa patologia. Obbiettivo del nostro progetto è di sviluppare un’efficace terapia, attraverso la conoscenza dei meccanismi responsabili della malattia, utili per identificare nuovi bersagli terapeutici, ma anche per definire biomarcatori del fenotipo patologico.
In questo progetto, abbiamo inizialmente reclutato e sottoposto a biopsia cutanea pazienti CMT2A con diverse mutazioni nel gene MFN2 in modo da ottenere fibroblasti pazienti specifici. La riprogrammazione di queste cellule mature in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) offre la possibilità di ottenere cellule paziente specifiche, come motoneuroni e neuroni sensitivi umani, tipicamente affetti nella patologia, ma impossibili da ottenere con altre strategie. In questo modo, abbiamo generato un modello in vitro di malattia, attualmente non disponibile. Sfruttando questa metodica, abbiamo ottenuto diverse linee di iPSC da pazienti CMT2A e abbiamo dimostrato il differenziamento in motoneuroni paziente specifici. Le cellule così ottenute hanno mostrato alcuni aspetti tipici della patologia, come la alterazioni della localizzazione dei mitocondri, riduzione della quantità del DNA mitocondriale e dell’attività dei complessi della catena respiratoria. Questi difetti sono risultati più evidenti nelle cellule neuronali rispetto ai fibroblasti, in accordo con la specificità neuronale della patologia.
Accanto ai modelli in vitro, abbiamo condotto le analisi degli stessi aspetti anche nell’unico modello murino attualmente disponibile di CMT2A (MitoCharc 1), per ampliarne la caratterizzazione alla ricerca di biomarcatori del fenotipo patologico.

In parallelo, ci siamo focalizzati sullo sviluppo di un approccio terapeutico per questa patologia. A questo proposito, abbiamo silenziato il gene MFN2 endogeno mediante short harpin RNA (shRNA) nei fibroblasti CMT2A. In parallelo, nelle stesse cellule, per recuperare i normali livelli di espressione del gene MFN2, abbiamo introdotto il c-DNA del gene MFN2 modificato in modo da resistere al processo di silenziamento. I risultati ottenuti con questa strategia nei fibroblasti CMT2A sono stati molto promettenti e ci hanno permesso di ottenere alcuni dati preliminari anche nel modello murino.
Questo studio ha contribuito ad approfondire i meccanismi molecolari patogenetici attraverso la generazione di un modello in vitro di CMT2A con iPSC paziente specifico e di identificare una possibile strategia terapeutica per la CMT2A.

Gli sviluppi futuri del nostro progetto di ricerca sono finalizzati a:
-aumentare il numero di linee di iPSC ottenute da pazienti con altre mutazioni nel gene MFN2 da differenziare successivamente in neuroni
-testare la nostra strategia terapeutica nei neuroni ottenuti dai pazienti
-applicare questa terapia nel modello murino della patologia attraverso l’utilizzo di vettori adeno-virali di tipo 9, capaci di trasferire specifiche molecole all’interno dei cellule neuronali, tipicamente coinvolte nella patologia.

Recentemente, in associazione a questi approcci, abbiamo progettato di testare un’innovativa tecnica di “genome editing”, ovvero un sistema di correzione della mutazione responsabile della malattia direttamente a livello del DNA. In particolare, il sistema che stiamo studiando è il CRISPR-CAS9, che deriva da un meccanismo di difesa immunitaria presente nei batteri, che ha promettenti potenzialità applicative nella correzione del DNA umano, come testimoniato dai numerosi riconoscimenti/premi scientifici attribuiti a questa scoperta nell’ultimo anno. Questa tecnologia si basa su un sistema che comprende una stringa guida complementare alla sequenza di DNA d’interesse, accoppiata ad un specifico enzima che ha la funzione di tagliare in maniera specifica il DNA. Il sistema permette, quindi, di legare specificatamente la sequenza di DNA in cui è presente la mutazione e di tagliarla grazie all’azione dell’enzima. Sulla base dei risultati soddisfacenti ottenuti in altre patologie, abbiamo pensato di applicare questa tecnica alla CMT2A per rimuovere la sequenza di DNA in cui è presente la mutazione responsabile della patologia, sostituendola direttamente con la sequenza di DNA corretta, permettendo quindi un ripristino corretto del gene mutato.
Questa strategia potrà essere sviluppata per un’applicazione terapeutica in trial clinici in pazienti.

Aggiornato a gennaio 2015

Sviluppo di approcci terapeutici cellulari e molecolari per la Malattia di Charcot-Marie-Tooth associata a mutazioni nel gene della mitofusina (CMT2A)

Corti S., Rizzo F., Ronchi D., Del Bo R., Nizzardo M., Comi G.P.

La malattia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 2A (CMT2A), il tipo più comune di CMT2, è causata da mutazioni nel gene della mitofusina 2 (MFN2). Per il trattamento della CMT2A, attualmente non è disponibile nessuna terapia efficace. In questo progetto, proponiamo due diversi approcci come possibili strategie terapeutiche: il primo basato sulla terapia cellulare e il secondo sull’uso dell’ oligomero antisenso Morpholino. Per testare queste strategie, useremo il modello murino MitoCharch1, caratterizzato dalla sostituzione amminoacidica R94Q (Arginina con Glutamina) per mimare la più comune mutazione associata alla CMT2A (Cartoni R. et al.; 2010).

Per quanto riguarda la terapia cellulare, un possibile approccio è quello di eseguire il trapianto di cellule staminali per fornire fattori di crescita che potrebbero avere un ruolo terapeutico sui neuroni CMT2A. Infatti abbiamo in precedenza dimostrato che il trapianto di cellule staminali neurali (NSC) può migliorare il fenotipo di modelli murini di malattie del motoneurone (MND) (Corti et al., 2006-2010). I fattori di crescita, come il fattore neurotrofico derivato dalla Glia (GDNF), mostrano effetti neuroprotettivi in modelli in vitro e in vivo di malattie neurodegenerative (Henderson CE et al.; 1994; Suzuki M et al.; 2007; 2008). Sulla base di questi dati, valuteremo il potenziale terapeutico delle NSC umane e delle cellule staminali miogeniche (MySC) ottenute da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) paziente specifiche, da sole o ingegnerizzate per esprimere fattori di crescita. Il nostro obiettivo è quello di isolare e caratterizzare le NSC e le MySC derivate da iPSCs, geneticamente modificate per overesprimere GDNF e di definire un adeguato protocollo di trapianto cellulare in topi transgenici CMT2A (somministrazione intratecale per le NSC e intramuscolare per le MySC). Una volta determinata la sopravvivenza e il potenziale differenziativo delle NSC/MySC in seguito al trapianto, studieremo il potenziale delle NSC/MySC wild-type e geneticamente modificate nel proteggere i neuroni e le giunzioni neuromuscolari, migliorando le funzioni neuromuscolare nel modello murino.

Per quanto riguarda la seconda strategia, è nostra intenzione utilizzare il morfolino fosforodiamidate (MO), oligonucleotide antisenso (ASO) di terza generazione con particolari modificazioni strutturali, progettato per ridurre il livello della proteina umana MNF2. L’uso del MO può offrire grandi promesse per il trattamento delle malattie umane sulla base dei risultati ottenuti recentemente in modelli murini di malattie del motoneurone (Porensky PN et al.; 2011). In questo progetto, vogliamo trasferire queste conoscenze alla CMT2A. In particolare testeremo il morfolino, capace di silenziare la proteina MNF2, in linee murine ed umane per valutare la riduzione della proteina in vitro. Cercheremo poi di definire il miglior protocollo di somministrazione nei topi MitoCharc1, stabilendo la dose e la modalità di iniezione, considerando somministrazioni locali (intracerebroventricolari e/o intratecali) e/o sistemiche (intravenose). Studieremo la biodistribuzione del MO e la sua capacità di ridurre i livelli dell’ mRNA e della proteina MNF2 nei modelli murini attraverso analisi di espressione genica e proteica. Determineremo inoltre l’efficacia terapeutica del MO nel migliorare il fenotipo neuromuscolare, rallentando la progressione della malattia e apportando un beneficio in termini di sopravvivenza nei topi MitoCharc1 trattati. Il nostro obiettivo è di definire un protocollo pre-clinico con il morfolino per ottenere una elevata riduzione dei livelli di MNF2 mutata con il minimo effetto tossico, offrendo così un approccio terapeutico clinicamente applicabile.



Aggiornato a novembre 2013